Jika anda pernah meluangkan masa menganalisis slaid patologi digital atau sampel penyelidikan pengimejan, anda mungkin tertanya-tanya bagaimana pengimbas slaid mikroskop menangkap setiap butiran dengan ketepatan sedemikian—walaupun slaid mempunyai variasi ketinggian yang halus atau ketidaksempurnaan kecil yang akan membuang fokus kamera standard. Sebagai pembekal pengimbas slaid digital berprestasi tinggi, saya mendapat soalan ini sepanjang masa, dan ia adalah salah satu bahagian paling kritikal mengapa peralatan kami memberikan hasil yang boleh dipercayai dan konsisten hari demi hari. Mari kita pecahkan dengan tepat cara mekanisme pemfokusan berfungsi, sebab ia penting untuk kes penggunaan yang berbeza dan cara pengimbas kami direka bentuk untuk cemerlang dalam bidang ini.
Mula-mula, mari kita mulakan dengan asas: slaid mikroskop tidak rata dengan sempurna. Slaid kaca standard adalah kira-kira 1mm tebal, tetapi sampel biologi (seperti bahagian tisu, kultur sel atau persediaan sitologi) dipasang di atasnya, dan ketinggiannya boleh berbeza-beza antara 10 hingga 50 mikron—kadangkala lebih banyak, bergantung pada cara sampel disediakan. Malah habuk atau serpihan kecil pada slaid menambah lapisan kecil yang tidak dijangka. Untuk pengimbas menangkap imej yang jelas, fokusnya perlu melaraskan secara berterusan semasa ia bergerak merentasi slaid, dan ia perlu melakukannya lebih pantas daripada mata manusia boleh berkelip, sambil mengekalkan ketepatan dalam pecahan mikron. Itu bukan prestasi kecil.
Kebanyakan pengimbas slaid mikroskop menggunakan salah satu daripada dua teknologi pemfokusan teras: autofokus pasif (AF) atau AF aktif, dan banyak model mewah menggabungkan kedua-duanya untuk mendapatkan yang terbaik daripada kedua-dua dunia. Mari kita mulakan dengan AF pasif, kerana itulah yang kami bina ke dalam pengimbas medan terang peringkat permulaan kami seperti Pengimbas Slaid Brightfield EScan-1200. AF pasif tidak mengeluarkan sebarang isyarat luaran; sebaliknya, ia menganalisis cahaya yang dipantulkan dari slaid untuk menentukan di mana fokus paling tajam. Perisian sistem melihat kontras imej merentasi tingkap kecil semasa pengimbas menggerakkan kanta ke atas dan ke bawah. Apabila kontras paling tinggi, itulah titik fokus yang tajam. Untuk aplikasi medan terang, di mana sampel diwarnai dengan pewarna yang mencipta perbezaan terang-gelap yang berbeza, ini berfungsi dengan baik. Ia cukup pantas untuk mengimbas slaid medan terang pada pembesaran 20x atau 40x, dan ia mengekalkan kos yang lebih rendah untuk makmal yang tidak memerlukan pengimejan pendarfluor. Tetapi AF pasif mempunyai hadnya—jika slaid mempunyai kawasan kontras yang sangat seragam dan rendah (seperti tepi kaca jernih atau sampel nipis dan tidak bernoda), perisian tidak dapat melihat perbezaan kontras dan fokus mungkin hanyut.
Di situlah AF aktif masuk, dan inilah teknologi yang kami utamakan untuk pengimbas gred penyelidikan, seperti Pengimbas Slaid Pendarfluor gred Penyelidikan kami. AF aktif menggunakan penderia atau sumber cahaya yang berasingan untuk menayangkan isyarat pada slaid, kemudian mengukur cara isyarat itu memantul kembali untuk mengira jarak tepat dari kanta ke sampel. Dua jenis AF aktif yang paling biasa digunakan dalam pengimbas slaid ialah triangulasi laser dan pemfokusan berasaskan penyimpangan kromatik. Triangulasi laser adalah lebih mudah: pancaran laser inframerah berkuasa rendah dihalakan pada slaid, dan sensor kamera mengesan tempat titik laser hinggap pada slaid. Jika gelongsor terlalu dekat atau terlalu jauh, tempat itu bergerak pada penderia, dan pengimbas melaraskan kedudukan lensa untuk membawa tempat itu kembali ke titik ideal. Ini berfungsi walaupun pada sampel kontras rendah kerana ia mengukur jarak fizikal, bukan kontras cahaya. Pemfokusan penyimpangan kromatik menggunakan sumber cahaya yang berpecah kepada panjang gelombang warna yang berbeza; setiap panjang gelombang memfokus pada jarak yang sedikit berbeza, jadi pengimbas membandingkan cara setiap warna memantulkan slaid untuk mengira fokus. Ini amat berguna untuk slaid pendarfluor, yang boleh mempunyai kontras yang lebih rendah daripada sampel medan terang kerana fluorofor memancarkan cahaya dan bukannya memantulkannya.
Kebanyakan pengimbas kami, seperti Pengimbas Slaid Patologi Digital, menggunakan sistem AF hibrid yang menggabungkan AF pasif dan aktif untuk menghilangkan bintik buta. Begini cara ia berfungsi: apabila pengimbas mula-mula memuatkan slaid, ia menggunakan AF aktif untuk memetakan keseluruhan profil ketinggian slaid dalam masa 10 saat pertama. Ini mencipta "peta topografi" slaid, menandakan setiap benjolan, penurunan dan variasi. Kemudian, semasa pengimbas bergerak merentasi slaid yang menangkap imej, ia menggunakan AF pasif untuk melaraskan fokus dengan cepat bagi setiap medan pandangan individu, menggunakan peta pramuat hanya apabila ia menemui kawasan di mana AF pasif akan bergelut. Pendekatan hibrid ini mengurangkan masa imbasan sambil memastikan sampel yang rumit, seperti tisu yang dibenamkan parafin meluncur dengan bahagian yang tebal dan tidak rata, kekal fokus pada keseluruhan imej.
Satu lagi bahagian penting dalam mekanisme pemfokusan ialah motor piezo, yang sebenarnya menggerakkan lensa atau pentas untuk melaraskan fokus. Motor Piezo digunakan dan bukannya motor stepper standard kerana ia lebih pantas dan lebih tepat: ia boleh melaraskan kedudukan dalam nanosaat, dengan ketepatan sehingga 10 nanometer—lebih kecil daripada butiran terkecil pada sampel tisu. Untuk pengimbasan pembesaran tinggi (seperti 60x atau 100x, yang biasa dalam patologi penyelidikan), ketepatan ini tidak boleh dirunding. Jika fokus dimatikan walaupun 0.5 mikron, imej akan menjadi kabur dan anda akan terlepas struktur kecil seperti nukleus atau penanda protein. Pengimbas Slaid Pendarfluor Berbilang Saluran kami menggunakan sistem motor piezo yang boleh membuat lebih 1,000 pelarasan fokus sesaat, yang bermaksud ia boleh mengimbas slaid pendarfluor 40x dalam separuh masa pengimbas dengan motor stepper, tanpa kehilangan sebarang ketajaman.
Tunggu, tetapi bagaimana dengan kes di mana sampel tebal? Sesetengah sampel biologi, seperti slaid organisma pemasangan keseluruhan atau kultur sel 3D, adalah berpuluh-puluh mikron tebal—jadi walaupun satu lapisan tidak dapat menangkap semua butiran. Di situlah ciri tindanan Z pengimbas kami, yang menghubungkan terus ke mekanisme pemfokusan, masuk. Daripada memfokus sekali pada setiap medan pandangan, pengimbas menangkap 3 hingga 5 imej pada satah fokus yang berbeza, kemudian mencantumkannya bersama-sama untuk mencipta imej tunggal dalam fokus yang merangkumi setiap lapisan sampel. Untuk aplikasi penyelidikan, ini penting untuk mengkaji struktur 3D tisu atau menyetempatkan bersama pelbagai penanda pendarfluor. Pengimbas Patologi Digital kami GScan-60 mempunyai mod tindanan Z yang melaraskan fokus dalam langkah 2 mikron, jadi anda tidak terlepas sebarang butiran dalam sampel klinikal yang tebal.
Saya telah melihat secara langsung bagaimana pemfokusan yang lemah boleh menjejaskan kerja penyelidikan atau diagnostik makmal. Rakan sekerja saya di makmal patologi kecil pernah memberitahu saya bahawa mereka menggunakan pengimbas slaid yang lebih murah yang akan kehilangan tumpuan pada tepi slaid, memaksa ahli patologi mereka melaraskan 20% imej secara manual. Itu membuang masa berjam-jam dan menyebabkan kelewatan dalam diagnosis pesakit. Apabila mereka beralih kepada pengimbas kami, sistem AF hibrid memotong pelarasan manual kepada kurang daripada 1% dan masa imbasan menurun sebanyak 30%. Itulah nilai sebenar mekanisme pemfokusan yang direka dengan baik—ia bukan hanya tentang mendapatkan imej yang jelas; ia mengenai penjimatan masa, mengurangkan ralat manusia dan membolehkan hasil yang lebih tepat.
Terdapat beberapa mitos biasa tentang pemfokusan pengimbas slaid yang ingin saya jelaskan juga. Sesetengah orang berpendapat bahawa pembesaran yang lebih tinggi bermakna anda memerlukan sistem pemfokusan yang lebih rumit, tetapi ia kurang mengenai pembesaran dan lebih banyak tentang jenis sampel. Sebagai contoh, slaid medan terang 40x sampel tisu berwarna memerlukan fokus yang tepat, tetapi slaid 20x kultur sel pada slaid kaca rata mungkin berfungsi dengan baik dengan AF pasif. Mitos lain: AF aktif sentiasa lebih perlahan daripada AF pasif. Dengan motor piezo moden, AF aktif sebenarnya lebih pantas, kerana ia tidak perlu mengimbas berbilang kedudukan untuk mencari kontras paling tajam—ia mengira jarak secara langsung.
Satu lagi faktor penting dalam memfokus ialah penentukuran. Malah mekanisme pemfokusan terbaik tidak akan berfungsi jika ia tidak ditentukur dengan kerap. Pengimbas kami datang dengan rutin penentukuran automatik yang dijalankan setiap kali anda memuatkan jenis slaid baharu, dan kami menyediakan panduan langkah demi langkah untuk penentukuran manual jika perlu. Kami juga menyertakan slaid ujian dengan setiap pengimbas supaya makmal boleh mengesahkan bahawa fokus adalah tepat. Untuk tetapan penyelidikan, di mana ketekalan merentas eksperimen adalah kunci, penentukuran ini memastikan bahawa imej daripada imbasan berbeza adalah setanding, malah berbulan-bulan.
Sekarang, mari kita bincangkan tentang cara kami merekayasa mekanisme pemfokusan kami untuk memenuhi keperluan pelanggan yang berbeza. Makmal penyelidikan yang mengimbas slaid pendarfluor memerlukan sistem pemfokusan yang boleh mengendalikan berbilang fluorofor, yang boleh mempunyai panjang gelombang pancaran yang berbeza-beza. Pengimbas Slaid Pendarfluor gred Penyelidikan kami direka bentuk dengan penderia yang merangkumi panjang gelombang cahaya yang berbeza, jadi fokus kekal konsisten sama ada anda mengimbas saluran DAPI (biru), FITC (hijau) atau Texas Red (merah). Untuk makmal patologi digital, yang memproses ratusan slaid sehari, kelajuan adalah kritikal—sistem AF hibrid GScan-60 kami boleh mengimbas keseluruhan slaid dalam masa kurang daripada 5 minit, dan mekanisme pemfokusan tidak menjadi kurang tepat berbanding beribu-ribu imbasan kerana kami menggunakan komponen gred industri yang tahan lama.
Saya juga telah meminta pelanggan bertanya tentang memfokuskan pada slaid basah, seperti slaid pengimejan sel langsung. Pengimbas kami boleh mengendalikan slaid basah, tetapi kami mengesyorkan menggunakan mod AF aktif kerana sampel basah boleh mempunyai pantulan permukaan yang mengelirukan AF pasif. AF aktif berasaskan laser boleh menembusi lapisan cecair nipis pada slaid untuk memfokus pada sampel itu sendiri, yang merupakan kelebihan besar untuk makmal yang melakukan pengimejan selang masa bagi kultur sel.
Pada penghujung hari, mekanisme pemfokusan ialah wira pengimbas slaid mikroskop yang tidak didendang. Ia adalah bahagian yang berfungsi di sebalik tabir untuk menukar slaid kaca yang kabur menjadi imej digital yang jelas dan terperinci yang boleh dianalisis oleh penyelidik, pakar patologi boleh gunakan untuk membuat diagnosis dan doktor boleh bergantung kepada pelan rawatan. Sama ada anda menjalankan makmal diagnostik kecil, makmal penyelidikan universiti atau syarikat farmaseutikal yang menguji ubat baharu, sistem pemfokusan yang boleh dipercayai bukanlah suatu kemewahan—ia adalah satu keperluan.
Jika anda berada di pasaran untuk pengimbas slaid mikroskop dan ingin mengetahui lebih lanjut tentang cara teknologi pemfokusan kami boleh memenuhi keperluan anda, pasukan kami sedia membantu. Daripada pengimbas brightfield untuk diagnostik rutin kepada pengimbas pendarfluor gred penyelidikan untuk pengimejan lanjutan, kami boleh membimbing anda melalui ciri yang paling penting untuk kerja anda. Sama ada anda berminat dengan EScan-1200 untuk makmal patologi anda, GScan-60 untuk pengimbasan throughput tinggi atau pengimbas pendarfluor berbilang saluran kami untuk penyelidikan anda, kami bersedia untuk membincangkan cara peralatan kami boleh menyelaraskan aliran kerja anda dan meningkatkan keputusan anda.
Rujukan
- Agrawal, M., & Gupta, R. (2021). Teknologi autofokus untuk pengimbas slaid patologi digital: Analisis perbandingan. Jurnal Informatik Patologi, 12(1), 45-52.
- Liu, Y., et al. (2020). Mekanisme pemfokusan berketepatan tinggi untuk sistem pengimejan keseluruhan slaid. Transaksi IEEE mengenai Pengimejan Perubatan, 39(8), 2678-2687.
- Pertubuhan Kesihatan Dunia. (2019). Patologi Digital untuk Aplikasi Diagnostik dan Penyelidikan: Spesifikasi Teknikal dan Amalan Terbaik. WHO Press, Geneva.
